Б1.В.ОД.11 Биохимические методы исследования

Вопросы для самоподготовки к экзамену по дисциплине Б1.В.ОД.11 Биохимические методы исследования:

1. Теоретические основы биохимического анализа. Задачи биохимического анализа. Планирование биохимического эксперимента.
2. Растворы и способы выражения концентрации.
3. рН-электрод и кислородный электрод.
4. Количественный биохимический анализ.
5. Центрифугирование. Типы центрифуг. Дифференциальное центрифугирование.
6. Условия выделения митохондрий. Компоненты, необходимые для приготовления сред для гомогенизации растительных тканей и инкубации митохондрий.
7. Сущность метода разделения органелл в градиенте плотности.
8. Определение чистоты полученного препарата митохондрий. Ферменты-маркеры.
9. Параметры, характеризующие дыхание, и методы их определения.
10. Окислительное фосфорилирование митохондрий, понятие о сопряженном и разобщенном дыхании. Способы определения степени сопряжения окислительного фосфорилирования митохондрий.
11. Понятие о метаболических состояниях митохондрий.
12. Параметры дыхательной активности митохондрий, определяемые полярографическим методом (скорость фосфорилирующего дыхания, скорость нефосфорилирующего дыхания, дыхательный контроль, отношение АДФ:О).
13. Ингибиторы окислительного фосфорилирования митохондрий.
14. Уровни структурной организации белков. Денатурация белков.
15. Разрушение клеток и получение грубого экстракта. Методы разрушения клеток.
16. Методы фракционирования белков. Мониторинг очистки белка.
17. Фракционирование белков с помощью солей.
18. Фракционирование белков с помощью хроматографии.
19. Фракционирование белков с помощью органических растворителей.
20. Количественные методы определения белков. Поглощение в УФ-диапазоне, метод Лоури, метод с бицинхониновой кислотой, метод Бредфорд, метод Кьельдаля.
21. Принцип электрофоретического анализа белковых смесей и его возможности.
22. Электрофорез в полиакриламидном геле в нативных и денатурирующих условиях.
23. Электрофорез по Лэммли.
24. Определение первичной структуры белков. Секвенирование. Масс-спектрометрия.
25. Двумерный электрофорез.
26. Принцип и назначение блоттинга, виды блоттинга.
27. Иммуноблоттинг (вестерн-блоттинг).
28. Основные условия получения и выращивания долговременной культуры клеток растений.
29. Искусственные питательные среды для культивирования клеток и тканей растений. Их главные компоненты.
30. Каллусная и суспензионная культуры растительных клеток. Получение и биологическая характеристика.
31. Использование культур клеток растений в научных и прикладных целях.
32. Получение изолированных протопластов. Сфера использования культуры изолированных протопластов. Принцип метода слияния изолированных протопластов.
33. Хозяйственно-ценные признаки, придаваемые основным видам сельскохозяйственных растений с помощью методов генетической трансформации  растений. Устойчивость к гербицидам.
34. Сомаклональная изменчивость в культуре клеток и у растений-регенерантов. Значение для науки и практики.
35. Методы генетической трансформации растений. Агробактериальная трансформация.
36. Методы генетической трансформации растений. Метод микроинъекций ДНК. Метод кокультивирования растительных протопластов со сферопластами бактерий.
37. Хозяйственно-ценные признаки, придаваемые основным видам сельскохозяйственных растений с помощью методов генетической инженерии. Устойчивость к вирусам и бактериальным инфекциям.
38. Методы генетической трансформации растений. Электропорация растительных протопластов. Метод генетической трансформации с помощью ДНК-нагруженных липосом.
39. Хозяйственно-ценные признаки, придаваемые основным видам сельскохозяйственных растений с помощью методов генетической инженерии. Увеличение содержания и изменения состава запасных белов семян. Увеличение содержания незаменимых аминокислот.
40. Методы генетической трансформации растений. Биобаллистический метод. Генная пушка.
41. Хозяйственно-ценные признаки, придаваемые основным видам сельскохозяйственных растений с помощью методов генетической инженерии. Устойчивость к насекомым-вредителям.
42. Методы генетической трансформации растений. Требования к векторным генетическим конструкциям с точки зрения биологической и экологической безопасности.
43. T-ДНК-индуцированные мутации. Коллекция мутантов арабидопсиса и ее применение в исследованиях по физиологии растений.
44. Характеристика явления «природной генетической инженерии». Методы генетической трансформации растений. Критерии генетического вектора. Требования к векторам прямой трансформации. 
45. Хозяйственно-ценные признаки, гены которых переносят в основные виды сельскохозяйственных растений. Стабильность наследования трансгена в поколениях.
46. Сайленсинг (замолкание трансгенов) у трансгенных растений. Возможные механизмы.
47. Генетическая трансформация митохондрий и хлоропластов. Современное состояние работ по клонированию генов в полуавтономных органеллах.

 

Раздел 3. Генетическая трансформация высших растений.

1. Характеристика основных методов генетической трансформации высших растений. Перенос генов с помощью генетических векторов (вирусы, плазмиды). Вакуумная инфильтрация суспензионных клеток Agrobacterium. Метод микроинъекций ДНК. Метод кокультивации растительных протопластов со сферопластами бактерий. Электропорация в применении к растительным протопластам. Трансформация протопластов с помощью ДНК-нагруженных липосом. Преимущества и недостатки методов генетической трансформации протопластов.
2. Биобаллистическая трансформация клеток растений. Генная пушка и принцип ее работы. Золотые или вольфрамовые сферические микрочастицы диаметром 0,4 – 1,2 мкм, покрытые ДНК, как средство доставки генетического материала в клетки. Эффективность переноса генов с помощью метода биобаллистической трансформации.
3. Перенос чужеродных генов в высшие растения на основе агробактериальной трансформации. Агробактериальная трансформация как природная генетическая инженерия. Опухолевые заболевания у растений. Агробактериальные плазмиды как фактор патогенеза. Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens. Структура и свойства. Октопиновые и нопалиновые плазмиды. Ri-плазмиды Agrobacterium rhizogenes. Структурная и функциональная организация Т-ДНК.
4. Этапы генетической трансформации растений с участием Agrobacterium tumefaciens. Бактериальная колонизация. Индукция бактериальной системы вирулентности. Формирование Т-ДНК-переносящего комплекса. Перенос Т-ДНК. Интеграция Т-ДНК в растительный геном.
5. Векторы агробактериальной трансформации. Векторы на основе Ti-плазмид. Челночный вектор pGV3850. Специализированные векторы для трансформации растений. Вектор pGA580 для скрининга промоторов и транзиентной и стабильной экспрессии у двудольных. Вектор pGA482 для стабильной и транзиентной экспрессии генов у двудольных. Способы отбора трансформированных клеток растений.
6. Задачи, решаемые с помощью агробактериальной трансформации. Признаки, избираемые для переноса в растения с помощью агробактериальной трансформации. Устойчивость к антибиотикам (канамицину). Устойчивость к гербицидам. Устойчивость к насекомым-вредителям. Сверхэкспрессия белок-кодирующих генов (ген Fe-содержащей суперокисддисмутазы и др.) с целью выяснения их физиологической роли в растительном организме.
7. Трансформация внеядерных геномов (геномов митохондрий и хлоропластов). Успешная генетическая трансформация дрожжевых митохондрий. Генетическая трансформация растительных хлоропластов. Генетическая трансформация митохондрий одноклеточных водорослей. Митохондриальные плазмиды растений как потенциальные генетические векторы репликативного и интегративного типа для клонирования генов в митохондриях. Научное и прикладное значение переноса генов во внеядерные органеллы растений.

 

Темы рефератов:

1. Роль генетических баз данных (EMBL) в работах по переносу генов в высших растениях.
2. Т-ДНК-индуцированные мутации у растений. Характеристика. Значение для фундаментальных и прикладных исследований.
3. Трансгеноз внеядерных генов. Современное состояние и перспективы.
4. Сомаклональная изменчивость в культуре клеток растений. Возможные биохимические механизмы. Теоретические и практические аспекты явления.
5. Гены-репортеры и их роль в работах по генетической трансформации высших растений.
6. Blue-Native и 2-D электрофорез в полиакриламидном геле для изучения протеома.
7. Особенности разрушения растительных тканей.
8. Флуоресцентные зонды для изучения митохондрий in situ.
9. Разобщители окислительного фосфорилирования. Ионофоры.

 

Литература

а) основная литература

1.  Биохимия [Электронный ресурс] : учеб. для академ. бакалавриата : для студ. вузов, обуч. по направл. 655500 "Биотехнология" / В. П. Комов. - 4-е изд., испр. и доп. - ЭВК. - М. : Юрайт, 2014. - 640 с. - (Бакалавр. Академический курс). - Режим доступа: ЭЧЗ "Библиотех". - Неогранич. доступ. - ISBN 978-5-9916-3929-3.
2. Молекулярно-генетические и биохимические методы в современной биологии растений [Текст] : научное издание / ред.: Вл. В. Кузнецов, В. В. Кузнецов, Г. А. Романов. - М. : Бином. Лаборатория знаний, 2012. - 487 с. : ил. ; 25 см. - (Методы в биологии). - Библиогр. в конце ст. - ISBN 978-5-9963-0738-8. (2 экз.).
3. Молекулярно-генетические и биохимические методы в современной биологии растений [Электронный ресурс] : научное издание. - ЭВК. - М. : Бином. Лаборатория знаний, 2012. - (Методы в биологии). - Режим доступа: ЭЧЗ "Библиотех". - 20 доступов. - ISBN 978-5-9963-0978-8.
4. Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии [Электронный ресурс] —2-е изд. (эл.). [Электронный ресурс] / К. Уилсон, Дж. ред. Уолкер. - Москва : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2015. - 855 с. : ил. - Режим доступа: ЭБС "Айбукс". - Неогранич. доступ. - ISBN 978-5-9963-2877-2 : Б. ц.

 

б) дополнительная литература

1. Биохимические основы химии биологически активных веществ [Электронный ресурс] : учеб. пособие : учеб. пособие для студ. вузов, обуч. по спец. "Хим. технология синтет. биол. активных веществ" / Л. В. Коваленко. - 2-е изд. - ЭВК. - М. : Бином. Лаборатория знаний, 2012. - (Учебник для высшей школы). - Режим доступа: ЭЧЗ "Библиотех". - 20 доступов. - ISBN 978-5-9963-1100-2.
2. Биохимия растений [Текст] : учебник / Г. -В. Хелдт ; пер. с англ. М. А. Брейгиной [и др.] ; ред.: А. М. Носов, В. В. Чуб. - М. : Бином. Лаборатория знаний, 2011. - 471 с. : ил. ; 26 см. - (Лучший зарубежный учебник). - Библиогр. в конце ст. - Указ.: с. 464-471. - Пер. изд. : Plant biochemistry / Hans-Walter Heldt. - 2005. - ISBN 978-5-94774-795-9. (3 экз.).

Литература по дисциплине Б1.В.ОД.11 Биохимические методы исследования

1.         Биотехнология растений: культура клеток / Ред. Р. Г. Бутенко. - М. : Агропромиздат, 1989. - 280 с.

2.         Биохимические основы химии биологически активных веществ [Электронный ресурс] : учеб. пособие : учеб. пособие для студ. вузов, обуч. по спец. "Хим. технология синтет. биол. активных веществ" / Л. В. Коваленко. - 2-е изд. - ЭВК. - М. : Бином. Лаборатория знаний, 2012. - (Учебник для высшей школы). - Режим доступа: ЭЧЗ "Библиотех". - 20 доступов. - ISBN 978-5-9963-1100-2.

3.         Биохимия [Электронный ресурс] : учеб. для академ. бакалавриата : для студ. вузов, обуч. по направл. 655500 "Биотехнология" / В. П. Комов. - 4-е изд., испр. и доп. - ЭВК. - М. : Юрайт, 2014. - 640 с. - (Бакалавр. Академический курс). - Режим доступа: ЭЧЗ "Библиотех". - Неогранич. доступ. - ISBN 978-5-9916-3929-3.

4.         Биохимия растений [Текст] : учебник / Г. -В. Хелдт ; пер. с англ. М. А. Брейгиной [и др.] ; ред.: А. М. Носов, В. В. Чуб. - М. : Бином. Лаборатория знаний, 2011. - 471 с. : ил. ; 26 см. - (Лучший зарубежный учебник). - Библиогр. в конце ст. - Указ.: с. 464-471. - Пер. изд. : Plant biochemistry / Hans-Walter Heldt. - 2005. - ISBN 978-5-94774-795-9. (3 экз.).

5.         Биссвангер Х. Практическая энзимология / Х. Биссвангер ; пер. с англ. – М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2012. – 328 с.

6.         Войников В. К. К вопросу о выделении интактных растительных митохондрий / В. К. Войников // Известия Сибирского Отделения Академии наук СССР. Серия биологических наук. - 1980. - Вып. 2. - С. 121 –126.

7.         Зеленский М. И. Полярографическое определение кислорода в исследованиях по фотосинтезу и дыханию / М. И. Зеленский. - Л. : Наука, 1986. - 140 с.

8.         Клонирование ДНК. Методы / Ред. Гловер Д. - М. : Мир, 1988. - С. 338-339.

9.         Кнорре Д. Г. Биологическая химия. 3-е изд. / Д. Г. Кнорре, С. Д. Мызина. - М.: Высшая школа, 2000. - 480 с.

10.       Коничев А.С. Молекулярная биология / А. С. Коничев, Г. А. Севостьянова. - М. : Академия, 2005. - 400 с.

11.       Корнберг А. Синтез белка / А. Корнберг ; под ред. Г. П. Георгиева. - М. : Мир, 1977. - 360 с.

12.       Молекулярно-генетические и биохимические методы в современной биологии растений [Текст] : научное издание / ред.: Вл. В. Кузнецов, В. В. Кузнецов, Г. А. Романов. - М. : Бином. Лаборатория знаний, 2012. - 487 с. : ил. ; 25 см. - (Методы в биологии). - Библиогр. в конце ст. - ISBN 978-5-9963-0738-8. (2 экз.).

13.       Молекулярно-генетические и биохимические методы в современной биологии растений [Электронный ресурс] : научное издание. - ЭВК. - М. : Бином. Лаборатория знаний, 2012. - (Методы в биологии). - Режим доступа: ЭЧЗ "Библиотех". - 20 доступов. - ISBN 978-5-9963-0978-8.

14.       Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие) / Л. А. Остерман. - М.: Наука, 1981. - 288 с.

15.       Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л. А. Остерман. - М.: Наука, 1985. - 536 с.

16.       Побежимова Т.П. Методы изучения митохондрий растений. Полярография и электрофорез / Т. П. Побежимова, А. В. Колесниченко, О. И. Грабельных ; отв. ред. Р.К. Саляев. – Москва: ООО « НПК «Промэкобезопасность», 2004. - 98 с.

17.       Практикум по биохимии / Под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. – М.: МГУ, 1989. – 509 с.

18.       Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии [Электронный ресурс] / К. Уилсон, Дж Уолкер. - Москва : Бином. Лаборатория знаний, 2013. - 848 с. - (Методы в биологии). - Режим доступа: ЭБС "Издательство "Лань". - Неогранич. доступ. - ISBN 978-5-9963-2126-1.

19.       Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом. - М. : Наука, 1973. - 222 с.

20.       Сердюк И. Н. Методы в молекулярной биофизике: структура, функция, динамика: учебное пособие. В 2 тт. / И. Сердюк, Н. Заккаи, Дж. Заккаи ; науч. ред. И. Сердюк. – М. : КДУ, 2010.

21.       Скоупс Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс ; пер. с англ. - М. : Мир, 1985. - 358 с.

22.       Справочник биохимика. Пер. с англ. / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. – М. : Мир, 1991. – 544 с.

23.       Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. Изд-во МГУ, 2005. 336 с.

24.       Уилсон Дж. Молекулярная биология клетки. Сборник задач / Дж. Уилсон, Т. Хант ; под ред. И. А. Крашенинникова. – М. : Мир, 1994. - 520 с.

25.       Эллиот В. Биохимия и молекулярная биология. Пер. с англ. / В. Эллиот, Д. Эллиот ; под ред. А. И. Арчакова, М. П. Кирпичникова, А. Е. Медведева, В. П. Скулачева. - М. : изд-во НИИ Биомедицинской химии РАМН, 2000. – 366 с.